Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт «Международный томографический центр»
Сибирского отделения Российской академии наук

Центр коллективного пользования

Центр коллективного пользования «Масс-спектрометрические исследования» СО РАН

Председатель наблюдательного совета – академик Ренад Зиннурович Сагдеев.

Руководитель – д.х.н. Юрий Павлович Центалович.

Контактная информация:

Тел.: (383)330-31-36
Факс: (383)333-13-99
Электронная почта: yura@tomo.nsc.ru

ЦКП «Масс-спектрометрические исследования» был создан при Международном томографическом центре СО РАН в 2010 году. За последние два года основная деятельность коллектива центра была направлена на исследование биохимических и фотохимических процессов, протекающих в живых организмах и являющихся ответственными за развитие социально-значимых заболеваний, таких как катаракта и описторхоз.

В настоящее время при исследовании патогенеза различных заболеваний активное применение находит новая развивающаяся область биохимии – протеомика, основным предметом изучения которой являются белки и их взаимодействия в живых организмах, в том числе человеческом. В основе инструментальных методов протеомики лежат методы масс-спектрометрического и хроматографического анализа, а также методы пробоподготовки биологических образцов. Современные методы протеомного анализа позволяют решать задачи по определению как качественного, так и количественного состава белков. Оборудование для масс-спектрометрии может быть использовано для поисковых и количественных исследований, идентификации одновременно нескольких белков или пептидов в составе сложных смесей, определения аминокислотной последовательности белков, наличия пост-трансляционных изменений, выявления и идентификации биомаркеров различной органической природы, проведения молекулярной визуализации тканей, идентификации микроорганизмов, а также для количественного анализа малых молекул в сложных смесях. Хроматографическое оборудование позволяет разделять белки и пептиды в составе сложных смесей по ряду параметров, проводить очистку интересующего белка, проводить оценку качества очистки белков и олигонуклеотидов.

P1000016edt.jpg


Основными методами ионизации в масс-спектрометрии считаются матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ) и ионизация электроспреем. На сегодняшний день центр оснащен рядом современных масс-спектрометров, среди них два сверхвысокопроизводительных масс-спектрометра с ионизацией пробы методом лазерной матричной десорбции и времяпролетными детекторами (MALDI-TOF): Autoflex и Ultraflex™III производства Bruker Daltonik GmbH. Эти приборы обладают чувствительностью на уровне аттомоль с высоким соотношением сигнал/шум, разрешением ≥ 25,000 и точностью выше 3 ррм для пептидного диапазона масс (до 6 000 Да) в отражательном режиме и лучше 80 ррм в линейном режиме для белковых образцов (до 1 000 000 Да), что делает успешной исследовательскую работу в области экспрессионной протеомики, количественного анализа и детального исследования биомаркеров. Тандемный времяпролетный масс-спектрометр Ultraflex™III включает источник ионов scoutMTP™ с системой широкодиапазонной импульсной экстракции ионов PAN™ для масс в диапазоне 700 - 6000 Да; модифицированный твердотельный лазер с регулируемой частотой импульсов от 1 до 200 Гц и технологией smartbeam™ для работы с различными методами пробоподготовки. Времяпролетный (TOF) анализатор для работы в линейном и отражательном режимах; тандемный блок LIFT™ для работы в TOF/TOF (MS/MS) режиме позволяет проводить анализ образца с фемтомолярным содержанием вещества за несколько секунд; блок для ударной диссоциации ионов (CID) с высокой энергией служит для фрагментации ионов. Метод с ионизацией MALDI позволяет установить молекулярную массу пептида или белка в сотни тысяч Дальтон с точностью вплоть до 0.01 %. Метод удобен для скринингового анализа, например, для установления молекулярных масс протеолитических пептидов в смеси после энзиматического расщепления белка.

Autoflex.JPG   Ultraflex1.JPG   Ultraflex2.JPG

Одним из новых приложений в сочетании с МАЛДИ масс-спектрометрией является система MALDI Imaging. Это система высокочувствительной МС-визуализации пространственных распределений белковых биомаркеров и лекарств в биологических и клинических исследованиях. Полное решение для imaging состоит из полностью автоматизированной станции для подготовки образцов ImagePrep (оборудование для нанесения матрицы на срезы биологических образцов), MALDI-TOF масс-спектрометра, а также программного обеспечения для анализа и статистической обработки данных. С использованием данного приложения и с помощью метода МАЛДИ в ЦКП была осуществлена визуализация распределения белков хозяина и паразита на срезе печени хомяка, пораженной Opisthorchis felineus на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex III.

ImagePrep.jpg   Srez1.jpg   Srez2.jpg  

В центре также реализована система быстрой и надежной идентификации и классификации микроорганизмов, бактерий, дрожжей и грибов MALDI BioTyper, основанная на специфичности для каждого штамма распределения сигналов на соответствующих протеомных профилях. Это уникальная технология определения по одиночным бактериальным колониям, непосредственно нанесенным на мишень MALDI, без предварительной ПЦР амплификации и использования селективных сред роста. Данный метод прост в пробоподготовке и обладает высоким пределом измерения (104-105 клеток) и скорости (один образец в минуту).

as.jpg

Помимо MALDI-TOF спектрометров, в центре установлены квадрупольно-времяпролетный масс-спектрометр maxis 4G (Bruker Daltonics) и ионная ловушка Esquire6000.

MaXis – это высокопроизводительный комбинированный масс-спектрометр с электроспрейной ионизацией и времяпролетным детектором для определения точной массы и неискаженного изотопного распределения в режимах MS и MS/MS, с разрешением более 50,000 FWHM, скоростью регистрации более 30 полных спектров в секунду и точностью на уровне sub-ppm. Включает электроспрейный источник ионизации Appolo II, высокоточный гиперболический квадруполь, ячейку соударений для ударной диссоциации ионов, времяпролетный анализатор с системой температурной компенсации, электронные системы. Высокое разрешение масс-спектрометра в сочетании с расширенным диапазоном масс и высокой точностью позволяет проводить идентификацию малых молекул, метаболитов, биомаркеров, а также высокоточный анализ белков. Данный прибор интегрирован с ВЭЖХ системой Dionex3000, что позволяет количественный анализ десятков метаболитов в биологических жидкостях и прочих комплексных смесях. Использование масс-спектрометра в качестве детектора ВЭЖХ позволяет проводить количественный анализ исследуемых соединений без предварительной трудоёмкой пробоподготовки образца или дериватизации непосредственно перед анализом. Разработана методика хроматографического разделения смеси метаболитов с масс-спектрометрической регистрацией компонентов. Обработка данных проводится с использованием программного обеспечения QuantAnalysis (Bruker Daltonics), которое позволяет в автоматическом режиме выделять отдельные компоненты смеси по току ионов с избранными массами и определять их концентрации по стандартным калибровочным кривым.

Maxis-Dionex.jpg    Maxis2.JPG

Разработанная методика метаболомного профилирования позволила с хорошей точностью выделить порядка 40 соединений с интервале молекулярных масс от 150 до 1000 Да. Данная работа была выполнена на хрусталиках подопытных животных – крысах линий Wistar и OXYS. В аминокислотном ряду количественно были определены следующие аминокислоты - глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистеин, фенилаланин, тирозин, метионин, триптофан, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, таурин и др., среди антиоксидантов - GSH, GSSG, а также AMP, NADH и др.

123.jpg

Esquire6000 - ионная ловушка с ионизацией образца электроспреем с усовершенcтвованной сиcтемой LC/MSn (до n=18) и регистрацией ионов в диапазоне 200-6000 m/z. Сочетает чрезвычайно высокую скорость сканирования и чувствительность с легкоуправляемыми программными средствами. Легко интегрируется с системами ВЭЖХ (Agilent 1200). Применяется для решения широкого круга задач в родственных областях протеомики, метаболомики, скрининга и идентификации веществ, а также химического анализа.

Trap4.JPG   Chromatograph.JPG

Для приготовления образцов в центре применяются различные методики пробоподготовки: электрофоретическое разделение белков в ПАА геле, очистка смесей на магнитных частицах, приготовление ультратонких срезов. Центр оснащен комплексом электрофоретического оборудования для проведения изоэлектрофокусировки, одномерного и двумерного электрофорезов. Оборудование включает в себя камеры, источники, все необходимые компоненты и аксессуары. Камеры для вертикального электрофореза Protean (Bio-Rad) мини и макси форматов позволяют проводить различные электрофорезы с размерами геля 8 и 18 см. Для документирования и обработки гелей используется система гель-документирования высокого разрешения и чувствительности VersaDoc (Bio-Rad).

VersaDoc.jpg   321.jpg

CLINPROT – система автоматизированной прободготовки, основанной на использовании магнитных частиц с нанесением пробы на MALDI-мишень AnchorChip. Интегрированный набор инструментов для поиска биомаркеров и клинической протеомики, предлагающий методологии и технологические подходы для клинических исследований с минимальными затратами времени.

Clinprot.JPG   CryoStar NX70.jpg

Получение ультратонких срезов биологических тканей осуществляется на микротом-криостате CryoStar NX70 (Thermo Scientific) – высокоточном, эргономичном, высококачественном криостате модульной конструкции с камерой охлаждения из нержавеющей стали, который позволяет производить моторизованную нарезку образцов с возможностью изменения скорости от 0 до 256 мм/с; толщина срезов варьируется от 0,5 до 500 мкм.

Центр также оснащен оборудованием для фотохимических исследований. Установка стационарного фотолиза предназначена для облучения образцов УФ и/или видимым светом с последующим ВЭЖХ анализом продуктов реакции. Установка лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ) позволяет регистрировать кинетики и спектры промежуточного поглощения в спектральном диапазоне 220-700 нм с временным разрешением 10 нс, в магнитных полях от 0 до 3000 гаусс, а также в широком температурном диапазоне. В состав установки входят два лазера – эксимерный лазер и Nd:YAG лазер, что позволяет использовать для фотовозбуждения исследуемых образцов лазерные импульсы с различной длиной волны – 266 нм, 308 нм, 355 нм, 532 нм. Флуориметр FLSP920 производства Edinburgh Instruments оснащен набором источников света и детекторов, позволяющих как регистрировать стационарные спектры флуоресценции, так и проводить кинетические исследования с пикосекундным временным разрешением в широком спектральном диапазоне.

Fluorimeter.JPG

В Центре имеется всё необходимое вспомогательное оборудование, включая многофункциональный ридер микропланшетов (Tecan), спектрофотометр Agilent 8453 (Hewlett-Packard), микроцентрифуги, вортексы, термостаты, шейкеры и прочее.